Enzym protease

Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường
có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease.
1.2.2. Phân loại Protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .


SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 5
Peptidase (Protease)
(E.C.3.4)
Exopeptidase
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidase
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidase
Carboxypeptidase
Serine proteinase
Cystein proteinase
Aspartic proteinase
Metallo proteinase
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô

Hình 1.3. Sơ đồ phân loại protease
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg,
subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và
thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường
hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 6
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 7
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Chương 2:
NGUỒN THU NHẬN ENZYM PROTEASE
2.1. Nguồn động vật:
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công
nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa
trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca
2+.
Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển
hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm
renin bị nhiểm pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó
dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ
sữa kém đi.
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như
ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
2.2. Nguồn thực vật:
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được
từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa,
vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng
tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng
dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục
tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica). Enzyme được sử dụng
thuỷ phân protein tự nhiên.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 8
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô

Hình 2.1. Nguồn thu enzyme Protease từ thực vật
2.3. Nguồn vi sinh vật:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều
loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và
một số loại nấm men.
 Vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6].
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất
(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt
động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 9
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và
có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clostridium.

Hình 2.2. Clostridium
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH
rộng 7-12 .
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 10
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô

Hình 2.3. Bacillus
 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả
năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp
chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng
có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho
mát.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 11
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô

Hình 2.4. Nấm mốc
 Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus

Hình 2.5. Xạ khuẩn
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 12
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ),
người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp
chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,
phản ứng trong hệ hai pha lỏng.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có
những lợi ích chính như sau:
• Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc
nhiều lần quanh năm.
• Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định
hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
• Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức
sản xuất.
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,
gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh
vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất,
chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 13
Đồ án Công nghệ 1 GVHD: Trần Thị Xô
Chương 3:
THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH ENZYM PROTEASE TỪ
VI SINH VẬT VÀ THỰC VẬT
3.1. Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật.
Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn.
Quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn
chủ yếu
Hình 3.1. Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme
SVTH: Trần Giang Vũ Vi Trang: 14
Tuyển chọn và cải tạo giống
vi sinh vật
Phương pháp bảo quản giống
vi sinh vật
Tách và làm sạch chế phẩm
enzim
Môi trường nuôi cấy vi sinh
vật sinh tổng hợp enzim

Xem chi tiết: Enzym protease