KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO

LINK DOWNLOAD MIỄN PHÍ TÀI LIỆU "KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO": http://123doc.vn/document/548505-khao-sat-su-tac-dong-cua-auxin-len-su-sinh-tr-ong-va-sinh-tong-hop-alkaloid-cua-cay-tr-ong-xuan-hoa-catharanthus-roseus-in-vitro.htm

v
hoa in vitro. Và lượng kết tủa quan sát được nhiều nhất là ở mẫu cây sau 28
ngày nuôi cấy trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l.
Phân tích và định lượng indol alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro
bằng hệ thống điện di mao quản: Hàm luợng catharanthine và vindoline của cây
Trường xuân hoa in vitro cao hơn so với hàm luợng catharanthine và vindoline
của cây in vivo, và hàm lượng catharanthine đạt được cao nhất là sau 28 ngày
nuôi cấy và vindoline là sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA
0,5 mg/l.




vi
SUMMARY

“STUDY ON IMPACT OF AUXIN ON THE GROWTH AND THE
SYNTHEIS ALKALOID IN Catharanthus roseus IN VITRO”
The effect of different growth regulator on growth and production of indol
alkaloid were studied in Catharanthus roseus. Shoots were grown in MS solid
medium containing different concentrations of growth regulators. Extracted
alkaloids were qualitative with Wagner reagent and analyzed by CE for
determination of indol alkaloid quantities. The growth regulators on the experiment
were NAA, IAA and the data were viewed for 7, 14, 21, 28, 35 days.
The experiment result showed that NAA at concentration of 0,5 mg/l and
IAA 1 mg/l resulted in elongation of roots and higher number of roots. The
qualitative results of all in vitro plants have appeared precipitates which the 28 - day
plant sample on the medium containing NAA 0,5 mg/l had the most. Analyses by
CE showed that the concentration of indol alkaloid (catharanthine and vindoline) in
the in vitro plant is more than in vivo plant, and these plants produce the highest
catharanthine after 28 days and vindoline after 7 days cultured in MS medium
adding NAA 0,5 mg/l.



vii
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa i
Lời cảm ơn iii
Tóm tắt iv
Summary vi
Mục lục vii
Danh sách các bảng xi
Danh sách các hình và sơ đồ xiii
Danh sách các chữ viết tắt xv
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3. Yêu cầu 2
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây 3
2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp 3
2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp 4
2.2. Alkaloid 4
2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus 7
2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa 7
2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa 8
2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa 9
2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa 13
2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa 13
2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh 14
2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp 15
2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng 15



viii
2.4.2. Nguồn đạm 16
2.4.3. Nguồn cacbon 16
2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen 16
2.4.5. Các chất khác 16
2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid 17
2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất 17
2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ 17
2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước 18
2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid 18
2.6.1. Phản ứng tạo tủa 19
2.6.2. Phản ứng tạo màu 19
2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid 20
2.7.1. Phương pháp cân 20
2.7.2. Phương pháp trung hòa 20
2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan 21
2.7.4. Phương pháp so màu 21
2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại 22
2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp 22
2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản 22
2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp 23
2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao 24
2.8.2. Xử lý với Elicitor 24
2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 24
2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất 24
2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học 25
CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu 26
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26




ix
3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự
sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro 26
3.3.1. Vật liệu 26
3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 26
3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ 26
3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy 26
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu 27
3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 27
3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA
đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27
3.3.4. Phương pháp tiến hành 29
3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng
xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA 29
3.4.1. Vật liệu 29
3.4.1.1. Mẫu kiểm tra 29
3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29
3.4.1.3. Hóa chất 30
3.4.2. Phương pháp nghiên cứu 30
3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây
Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner 30
3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây
Trường xuân hoa 31
3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây
Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo 31
3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây
Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE 32
3.4.3. Phương pháp tiến hành 32
3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa 32



x
3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa 32
3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE 34
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56
5.1. Kết luận 56
5.2. Đề nghị 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO 58
PHỤ LỤC





xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây 13
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự
sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 27
Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh
trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự
sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro 28
Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 35
Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36
Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35
ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l 36
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 37
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của
cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy 38
Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa
in vitro bằng thuốc thử Wagner 41
Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 43
Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa
in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau 46
Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và
mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE 50

N2
N3
N1
I2



xii
Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE 53
Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây
Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy 54




xiii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid 7
Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa 7
Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa 8
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine 10
Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline 10
Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine 11
Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây
Trường xuân hoa từ tiền chất 12
Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung
NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy 39
Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây
Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày 42
Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường
xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 42
Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân
lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA 44
Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá
của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 45
Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA 46
Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây
Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA 47
Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l 48
Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo tươi 49
Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu
Trường xuân hoa in vivo khô 50



xiv
Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây
Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. 52
Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây
Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi 52
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi 33
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô 34
Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích
cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 51
Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa
cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo 53